信息

质粒标签	N-g3 signal，C-E tag
原核抗性	Amp 氨苄青霉素
克隆菌株	TG1
培养条件	37℃
质粒宿主	大肠杆菌
质粒用途	蛋白表达,抗体表达
片段类型	噬菌体

---

简介

       本系统是用于抗体基因表达，制备重组抗体。宿主菌 TG1 为质粒载体pCANTAB5e 复制和表达的宿主菌，无抗性，用 2×YT 培养基，37℃进行培养。载体 pCANTAB5e 为用于构建重组单链抗体 scFv 的载体，具有氨苄抗性，大小为4522bp，具体图谱及酶切位点如下示。辅助噬菌体 M13K07 用于拯救噬菌粒，具有卡那抗性，在其辅助下噬菌粒得以复制，并以融合的形式表达在噬菌体表面。在 scFv 基因后面含有一段编码 Tag 尾肽（E-Tag）的序列，在尾肽后面有一琥珀（Amber）终止密码子，位于 scFv 基因与 cpIII 基因之间，在抑制型细菌 TG1 中，这种琥珀密码子只有 20％有效，故在蛋白翻译过程中可以通读而形成 scFv-cpIII融合蛋白；但在非抑制型菌株中，如 HB2151，此终止子被识别，同时 scFv 基因在翻译过程中在 cpIII 基因前终止，形成独立的抗体蛋白，滞留于细胞膜间隙，并在长时间培养后泄漏在培养液中，形成可溶性表达。
【操作方法】本方法来源于网络，本平台未做实验证实，仅供参考
1. 辅助噬菌体毒种制备
       1) 将辅助噬菌体 M13K07 划线于 2×YT 琼脂平板上；
       2) 制备 2×YT 半固体琼脂（0.7％琼脂）为上层琼脂（Top Agar），冷却至 50 ℃时，取 4 mL Top Agar 并加入 0.5 mL 过夜培养的新鲜 TG1 菌（OD660 达 0.8），充分混匀，沿着划线浓度从低至高的方向，倾注 Top Agar；
       3) 37℃培养 6-12 小时，用接种针挑取单个噬菌斑，接种于 30-200 mL 2×YT-K（kanamycin 70 μg/mL），37℃充分振荡培养 10-14 小时；
       4) 8000 rpm 离心 15 min，4 ℃；
       5) 小心取上清，建议用 0.45μm 滤膜过滤后，分装无菌小管，存放 4℃至少可用半年。
2．噬菌体毒种的滴定
       1) 准备不含任何抗生素的 2×YT 培养平板 5-6 个；
       2) 用 2×YT 培养基配制 0.7%琼脂平板，即为表层琼脂（Top Agar），冷却至 42℃并在 42℃恒温保存；
       3) 将上述噬菌体溶液用培养基做 10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 稀释；
       4) 取过夜培养的 TG1 菌液（OD660=1 左右），分装小试管，500μL /小试管，标明10-6 至 10-10 稀释度；
备注：宿主菌的制备请参照 TG1 菌株说明书进行。
       5) 加入以上步骤 3 中依次稀释的噬菌体 100μL 到每个相应的标准稀释度的试管中，充分混匀，37℃轻柔振荡反应 30 min；
       6) 加入 Top Agar 3 mL 至每个试管中，立即浇注事先准备好的平皿，37℃培养过夜；
       7) 计算平皿上的空斑数，乘于相应稀释倍数，一般浓度可达 1012pfu/mL。
【注意事项】
1．噬菌体毒种，在使用前应按以上推荐的方法进行浓度滴定；
2．噬菌体毒种存放在 4℃下即可，不可-20℃或更低温度冻存；

---

图谱