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载体 pGRE-Luc 可以用来检测 GRE 信号通路活性。载体 pGRE-Luc 含有萤火虫来源的荧光 素酶基因。这个载体也包含多拷贝的 GRE 结合位点序列,并且该序列和一段 TATA-类似启 动子(PTAL)融合在一起,PTAL 源于单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子。当内源性 的 GRE 蛋白结合到 GRE 增强元件时,转录起始,报告基因开始表达。 荧光素酶编码序列后有一段 SV40 多聚腺苷酸信号以确保在真核细胞中能正确有效的转录。 在 GRE 结合位点的上游有一段合成的转录抑制区(TB),该区域由多聚腺苷酸信号与转录 终止位点组成,以减少转录背景。该载体骨架也包含了一个 f1 复制起始区域以便进行单链 DNA 的复制,一个 pUC 复制起始位点以及一个氨苄抗性基因,便于进行培养筛选。 载体 pGRE-Luc 用来检测转录因子 GRE 与 GRE 增强子的作用,提供了直接检测这条通路活 性的途径。该载体可以和一个目的基因的表达载体共转来观察,其是否影响这条通路的活性。 荧光素酶是一种高敏感性的酶原性报告蛋白,适用于任何一种标准的荧光素酶检测法,可以 用来定量表达水平。pGRE-Luc 载体可以用任何一种标准的方法转染至哺乳动物细胞。为了 筛选稳定克隆,转染的载体通常含有抗性筛选基因如:neomycin,hygromycin 或者 puromycin。 合适的宿主系:DH5α 以及一些其他通用系。进行单链 DNA 的合成宿主菌需要包含一个 F’ episome,比如 JM109。 筛选标记:质粒为宿主 E.coli 提供了氨苄抗性(100ug/ml) E.coli 复制起始位点:pUC 拷贝数:~500 不相容质粒:pMB1/ColE1
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